扫描电子显微镜样品制备

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本文目录:

• 1、用扫描电子显微镜进行形貌分析有哪些特点

• 2、扫描电镜

• 3、FTIR和SEM是什么?

• 4、透射电子显微镜的样品制作要求有哪些

一、用扫描电子显微镜进行形貌分析有哪些特点

放大倍率大。。高达几十万倍。。

分辨率高。。几个nm

景深大

成本高

样品可能需要前处理

操作较复杂

以下抄来的：

和光学显微镜及透射电镜相比，扫描电镜SEM（Scanning Electron Microscope）具有以下特点：

(一) 能够直接观察样品表面的结构，样品的尺寸可大至120mm×80mm×50mm。

(二) 样品制备过程简单，不用切成薄片。

(三) 样品可以在样品室中作三度空间的平移和旋转，因此，可以从各种角度对样品进行观察。 　

(四) 景深大，图象富有立体感。扫描电镜的景深较光学显微镜大几百倍，比透射电镜大几十倍。

(五) 图象的放大范围广，分辨率也比较高。可放大十几倍到几十万倍，它基本上包括了从放大镜、光学显微镜直到透射电镜的放大范围。分辨率介于光学显微镜与透射电镜之间，可达3nm。

(六) 电子束对样品的损伤与污染程度较小。

(七) 在观察形貌的同时，还可利用从样品发出的其他信号作微区成分分析。

二、扫描电镜

扫描电子显微镜(SEM)是1965年以后才迅速发展起来的新型电子仪器。其主要特点可归纳为：①仪器分辨率高；②仪器的放大倍数范围大，一般可达15～180000倍，并在此范围内连续可调；③图像景深大，富有立体感；④样品制备简单，可不破坏样品；⑤在SEM上装上必要的专用附件——能谱仪(EDX)，以实现一机多用，在观察形貌像的同时，还可对样品的微区进行成分分析。

一、扫描电子显微镜(SEM)的基本结构及原理

扫描电镜基本上是由电子光学系统、信号接收处理显示系统、供电系统、真空系统等四部分组成。图13-2-1是它的前两部分结构原理方框图。电子光学部分只有起聚焦作用的汇聚透镜，它们的作用是用信号收受处理显示系统来完成的。

图13-2-1 SEM的基本结构示意图

在扫描电镜中，电子枪发射出来的电子束，经3个电磁透镜聚焦，成直径为20 μm～25 Å的电子束。置于末级透镜上部的扫描线圈能使电子束在试样表面上做光栅状扫描。试样在电子束作用下，激发出各种信号，信号的强度取决于试样表面的形貌、受激区域的成分和晶体取向。试样附近的探测器把激发出的电子信号接受下来，经信号处理放大系统后，输送到阴极射线管(显像管)的栅极以调制显像管的亮度。由于显像管中的电子束和镜筒中的电子束是同步扫描的，显像管亮度是由试样激发出的电子信号强度来调制的，由试样表面任一点所收集来的信号强度与显像管屏上相应点亮度一一对应，因此试样状态不同，相应的亮度也必然不同。由此，得到的像一定是试样形貌的反映。若在试样斜上方安置的波谱仪和能谱仪，收集特征X射线的波长和能量，则可做成分分析。

值得注意的是，入射电子束在试样表面上是逐点扫描的，像是逐点记录的，因此试样各点所激发出来的各种信号都可选录出来，并可同时在相邻的几个显像管上或X—Y记录仪上显示出来，这给试样综合分析带来极大的方便。

二、高能电子束与样品的相互作用

并从样品中激发出各种信息。对于宝石工作者，最常用的是二次电子、背散射电子和特征X射线。上述信息产生的机理各异，采用不同的检测器，选择性地接收某一信息就能对样品进行成分分析(特征X射线)或形貌观察(二次电子和背散射电子)。这些信息主要有以下的特征：

1.二次电子(SE)

从距样品表面100 Å左右的深度范围内激发的低能量电子(一般为0～50 eV左右)发生非弹性碰撞。二次电子像是SEM中应用最广、分辨率最高的一种图像，成像原理亦有一定的代表性。高能入射电子束(一般为10～35 keV)由扫描线圈磁场的控制，在样品表面上按一定的时间、空间顺序作光栅式扫描，而从试样中激发出二次电子。被激发出的二次电子经二次电子收集极、闪烁体、光导管、光电倍增管以及视频放大器，放大成足够强的电信号，用以调制显像管的亮度。由于入射电子束在样品上的扫描和显像管的电子束在荧光屏上的扫描用同一个扫描发生器调制，这就保证了样品上任一物点与荧光屏上任一“像点”在时间与空间上一一对应；同时，二次电子激发量随试样表面凹凸程度的变化而变化，所以，显像管荧光屏上显现的是一幅明暗程度不同的反映样品表面形貌的二次电子像。由于二次电子具有低的能量，为了收集到足够强的信息，二次电子检测器的收集必须处于正电位(一般为+250 V )，在这个正电位的作用下，试样表面向各个方向发射的二次电子都被拉向收集极(图13-2-2a)，这就使二次电子像成为无影像，观察起来更真实、更直观、更有立体感。

2.背散射电子(BE)

从距样品表面0.1～1 μm的深度范围内散射回来的入射电子，其能量近似等于原入射电子的能量发生弹性碰撞。背散射电子像的成像过程几乎与二次电子像相同，只不过是采用不同的探测器接收不同的信息而已，如图13-2-2所示。

图13-2-2 二次电子图像和背散射电子图像的照明效果

(据S.Kimoto，1972)

a：二次电子检测方法；a′：二次电子图像的照明效果；b：背散射电子检测方法；b′：背散射电子图像的照明效果

3.特征X射线

样品中被激发了的元素特征X射线释放出来(发射深度在0.5～5μm范围内)。而要对样品进行微区的元素的成分分析，则需借助于被激发的特征X射线。这就是通常所谓的“电子探针分析”，又通常把测定特征X射线波长的方法叫波长色散法(WDS)；测定特征X射线能量的方法叫能量色散法(EDS)。扫描电子显微镜除了可运用于宝玉石的表面形貌外，它经常带能谱(EDS)做成分分析。EDS主要是由高效率的锂漂移硅半导体探测器、放大器、多道脉冲高度分析器和记录系统组成。样品被激发的特征X射线，入射至锂漂移硅半导体探测器中，使之产生电子—空穴对，然后转换成电流脉冲，放大，经多道脉冲高度分析器按能量高低将这些脉冲分离，由这些脉冲所处的能量位置，可知试样所含的元素的种类，由具有相应能量的脉冲数量可知该元素的相对含量。利用此方法很容易确定宝石矿物的成分。

扫描电镜若带有能谱(EDS)则不但可以不破坏样品可运用于做宝玉石形貌像，而且还能快速做成分分析(如图13-2-3，廖尚仪，2001)。因此它是鉴定和区别相似宝玉石矿物的好方法，如红色的镁铝榴石，红宝石、红尖晶石、红碧玺等，因为它们的成分不同，其能谱(EDS)图也就有较大的区别。波谱(WDS)定量分析比能谱(EDS)定量分析精确，但EDS分析速度快。

图13-2-3 蓝色钾-钠闪石的能谱图

三、SEM的微形貌观察

1.样品制备

如果选用粉状样，需要事先选择好试样台。如果是块状样，最大直径一般不超过15mm。如果单为观察形貌像，直径稍大一些(39mm)仍可以使用，但试样必须导电。如果是非导电体试样，必须在试样表面覆盖一层约200 Å厚度的碳或150 Å的金。

2.SEM形貌像的获得

图13-2-4 扫描电子显微镜下石英(a)和蓝色闪石玉(b)的二次电子像

观察试样的形貌，常用二次电子像或背散射电子像。图13-2-4是石英(a)和蓝色闪石玉(钾-钠闪石b)的二次电子像。同时由于二次电子像具有较高的分辨率和较高的放大倍数，因此，比背散射电子像更为常用。而成分分析则常采用背散射电子像。

三、FTIR和SEM是什么?

FTIR是指红外光谱仪器的第三代傅立叶变换红外吸收光谱仪（FTIR)。SEM是1965年发明的较现代的细胞生物学研究工具扫描电子显微镜。

四、透射电子显微镜的样品制作要求有哪些

①快速冷冻，用致冷剂（如液氮、液体氟利昂、液体丙烷等）或其他方法使生物材料急剧冷冻，使组织和细胞中的水只能冻结成体积极小的冰晶甚至无定形的冰──玻璃态。这样，细胞结构不致被冰晶破坏，生物大分子可保持天然构型，酶及抗原等能保存其生物活性，可溶性化学成分（如小分子有机物和无机离子）也不致流失或移位。用冷冻的组织块，可进行切片、冷冻断裂、冷冻干燥和冷冻置换等处理。用此法固定的样品既可提供组织、细胞结构的形态学信息，又可提供相关的细胞化学信息。②化学固定，固定剂有凝聚型和非凝聚型两种，前者如光学显微术中常用的乙醇、二氯化汞等，此法常使大多数蛋白质凝聚成固体,结构发生重大变化,常导致细胞的细微结构出现畸变。非凝聚型固定剂包括戊二醛、丙烯醛和甲醛等醛类固定剂和四氧化锇，四氧化钼等，适用于电子显微。它们对蛋白质有较强的交联作用,可以稳定大部分蛋白质而不使之凝聚,避免了过分的结构畸变。它们与细胞蛋白质有较强的化学亲和力，固定处理后，固定剂成为被固定的蛋白质的一部分。如用含有重金属元素的固定剂四氧化锇（也是良好的电子染色剂）进行固定，因为锇与蛋白质结合，增强了散射电子的能力，提高了细胞结构的反差。采用一种以上固定剂的多重固定方法，如采用戊二醛和四氧化锇的双固定法，能较有效地减少细胞成分的损失。此外，固定剂溶液的浓度、pH及所用的缓冲剂类型、渗透压、固定时间和温度等对固定效果都有不同程度的影响。

固定操作方法通常是先将材料切成 1立方毫米左右小块，浸在固定液中，保持一定温度（通常为4℃）,进行一定时间的固定反应。取材操作要以尽可能快的速度进行，以减少组织自溶作用造成的结构破坏。对某些难以固定的特殊组织，如脑、脊髓等，最好使用血管灌注方法固定，即通过血管向组织内灌注固定液，使固定液在组织发生缺氧症或解剖造成损伤之前，快速而均匀地渗透到组织的所有部分。灌注固定的效果比浸没固定好得多。

脱水化学固定后，将材料浸于乙醇、丙酮等有机溶剂中以除去组织的游离水。为避免组织收缩，所用溶剂需从低浓度逐步提高到纯有机溶剂，逐级脱水。

浸透脱水之后，用适当的树脂单体与硬化剂的混合物即包埋剂，逐步替换组织块中的脱水剂，直至树脂均匀地浸透到细胞结构的一切空隙中。

包埋浸透之后,将组织块放于模具中,注入树脂单体与硬化剂等混合物，通过加热等方法使树脂聚合成坚硬的固体。用作包埋剂的树脂有甲基丙烯酸酯、聚酯和环氧树脂等。最广泛使用的是某些类型的环氧树脂，如618树脂、Epon812、Araldite和 Spurr等商品树脂。它们具有良好的维持样品特性、低收缩率和较强的耐电子轰击能力等优点。

切片制备超薄切片要使用特制超薄切片机（大多是根据精密机械推进或金属热膨胀推进原理制成）和特殊的切片刀（用断裂的玻璃板制成的玻璃刀或用天然金刚石研磨而成的金刚石刀）。先将树脂包埋块中含有生物材料的部分，用刀片在立体显微镜下修整成细小的金字塔形,再用超薄切片机切成厚度适中（500埃左右）的超薄片，切片应依次相互联接形成切片带。切片带漂浮于装在切片机上的水槽中的水面上。

通过装置在切片机上的解剖显微镜，监控切片过程。用荧光灯照射水面上的切片，并根据由此产生的干涉光颜色来判断切片的实际厚度（见表）。

切片通常用敷有薄的支持膜的特制金属载网，从水面上捞取。快速冷冻固定的生物材料，可用冷冻超薄切片装置制成切片。用醛类或冷冻方法固定的组织，可通过超薄切片术与生物化学技术、免疫技术等结合使用,进行超微结构水平上的蛋白质、核酸、酶及抗原等生物活性物质的定位甚至定量研究。这就是电镜细胞化学技术（见细胞化学）和电镜免疫细胞化学技术。

染色电子显微镜主要是依赖散射电子成像，为了增强细胞结构的电子反差，需要对切片进行染色。染色是依据各种细胞结构与染色剂（重金属盐）结合的选择性，而形成不同的对电子散射能力，从而产生借以区别各种结构的反差。电子染色方法分块染色和切片染色两种：①块染色法，在脱水剂中加入染色剂，在脱水过程中对组织块进行电子染色。②切片染色法，最常用，即将载有切片的金属载网漂浮或浸没在染色液中染色。也可使用有微处理机控制的染色机进行自动化染色。一般切片染色所使用的染色剂为金属铀盐和铅盐的双重染色。为显示某种特殊结构，则可采用与该结构有特异性结合的选择性染色剂。

冷冻置换法用有机溶剂（如丙酮、乙醚等）在低温条件下（通常，-80～-90℃），缓慢地置换冷冻固定的小块组织中的冰（“惰性脱水”），这样可减少常规方法脱水过程中有机溶剂对组织中化学组分的抽取。然后再按常规方法进行树脂包埋、超薄切片和染色等。用冷冻置换法，可以很好地保存快速变化过程中物质的状态和非常脆弱的超微结构以及细胞内某些化学组分。

电镜放射自显影技术用超薄切片术与放射性同位素标记技术相结合的电镜放射自显影术(见同位素技术)可获得同位素标记的化合物在组织细胞内存在部位，以及在代谢过程中物质的合成、分解、转运及分泌的信息。

负染色和投影技术 研究分散的颗粒状生物材料,为增强其反差，常采用的方法。

负染色研究以蛋白质为主要成分的颗粒状材料的最常用方法。以某些在电子束轰击下稳定而又不与蛋白质相结合的重金属盐类作为负染色剂，使之在支持膜上将颗粒材料包围，形成具有高电子散射能力的背景，衬托出低电子散射能力的颗粒的形态细节。其所成的电子显微像的反差与常规电子染色相反，即暗的背景和亮的颗粒形态的所谓阴性反差。负染色方法简便，所获得的颗粒的电子显微图像反差强,分辨率也高于超薄切片,可广泛用于研究蛋白质分子、细菌鞭毛、蛋白质结晶，以及生物膜及分离的细胞的细微结构，特别适用于蛋白质大分子及病毒颗粒结构的三维重建研究。常用的负染色剂有醋酸铀、磷钨酸钠或磷钨酸钾、 硅钨酸、 铜酸铵及甲酸铀等。用液滴法或喷雾法将颗粒材料的悬液加在载网的支持膜上，然后滴加负染色剂溶液。或将颗粒的悬液与负染色剂按一定浓度混合滴加或喷撒到支持膜上，吸去多余液体，待干燥后，即可用电镜观察。样品颗粒在支持膜上的均匀分散是成功的关键之一。染色剂溶液的pH则是成功的另一关键。一般染色剂的pH应在中性偏酸范围（pH 5～7）,但对不同种类的颗粒材料和染色剂，最适pH也不尽相同。

投影 在真空蒸发器的高真空腔中,加热某些金属至熔化后，金属以细小颗粒沿直线方向蒸发出来。当金属微粒以一定入射角喷镀在载有颗粒材料的载网支持膜表面上时,颗粒向蒸发源的一面即被镀上一层金属薄膜,而背蒸发源的一面及附近区域形成无金属沉积的“阴影”，并且由于各部位散射电子能力存在着差别，这样就能构成具有强烈反差和立体感的电子显微图像。常用于投影的蒸发材料，有金、 铬、 铂、钯以及铂-铱、铂-钯、铂-碳等金属或合金。此外，还可利用电子枪投影装置使钨、钽等高熔点金属以极微细颗粒蒸发，从而获得高分辨率投影。

蛋白质展膜技术用电子显微镜研究核酸分子常用的方法。某些碱性球蛋白，如细胞色素c,可以在低浓度盐溶液或蒸馏水表面展成单分子层，在展开过程中，能为蛋白质的碱性氨基酸侧链基团所吸附的、带负电荷的核酸分子同时展开成完整的线状分子。然后，用带有支持膜（有机膜或碳膜）的载网捞起这些蛋白质──核酸展膜,并用染色或金属投影法提高核酸分子的反差,可在电镜下直接观察核酸分子的形态、DNA的双螺旋结构,并可通过分子长度的测量来计算核酸分子量。

冷冻断裂和冰冻蚀刻技术研究细胞超微结构，特别是生物膜结构的一种独特的样品制备技术。利用快速冷冻方法固定的生物组织块具有刚性和脆性。在对其施加外力后，组织即在结构上结合最薄弱的部位发生“脆性断裂”，这就是“冷冻断裂”。对于生物膜，断裂沿膜内部疏水区发生，从而暴露出膜内部结构。利用投影和复型技术，制备断裂面的复型,然后将组织腐蚀掉,并用载网捞起复型膜，就可用电镜来研究组织断裂表面所显示的细胞的或生物膜内部超微结构。在高于 10毫米汞柱真空度和-100℃温度下，冷冻组织的断裂表面上的冰升华为水蒸汽，而使原表面高度下降，即谓之“冰冻蚀刻”。由于组织各部分结构的含水量不同，冰的升华造成各部分结构的表面高度下降程度有差异，因此冰冻蚀刻的断裂表面的投影、复型所显示的断裂表面形态具有很强的立体感。冷冻断裂和冰冻蚀刻技术，为细胞超微结构，特别是关于细胞联接、细胞融合、细胞分化以及生物膜的通透性的研究提供了许多重要信息。也为流行的生物膜结构模型，即“流动镶嵌模型”的研究提供了有利的证据。

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