instructGPT原理（gst pulldown原理）

大家好！今天让创意岭的小编来大家介绍下关于instructGPT原理的问题，以下是小编对此问题的归纳整理，让我们一起来看看吧。

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本文目录:

• 1、05-ELMo/BERT/GPT-NLP预训练模型

• 2、关于硬盘MBR模式下的分区和系统启动的问题，请多指教！

• 3、GOT比GPT高

• 4、比chatgpt更新的技术是

一、05-ELMo/BERT/GPT-NLP预训练模型

这里可以参考CSDN上的文章-BERT原理和实践： https://blog.csdn.net/jiaowoshouzi/article/category/9060488

在解释BERT，ELMO这些预训练模型之前，我们先看一下很久之前的计算机是如何读懂文字的？

每个字都有自己的独特的编码。但是这样是有弊端的，字和字之间的关联关系是无法得知的，比如计算机无法知道dog和cat都是动物，它反而会觉得bag和dog是比较相近的。

所以后来就有了Word Class，将一系列的词进行分类然后让一类词语和一类词语之间更有关联，但是这样的方法太过于粗糙，比如dog，cat，bird是一类，看不出哺乳动物鸟类的区别。

在这个基础之上，我们有了Word Embedding，Word Embedding我们可以想象成是一种soft的word class，每个词都用向量来表示，它的向量维度可能表示这个词汇的某种意思，如图中dog，cat，rabbit的距离相比其他更近。那么word embendding是如何训练出来的，是根据每个词汇的上下文所训练的。

每个句子都有bank的词汇，四个bank是不同的token，但是同样的type。（注：token-词例， type-词型， class-词类 or token是出现的总次数(还有种理解是token是具有一定的句法语义且独立的最小文本成分。 )，type是出现的不同事物的个数。）

对于典型的Word Embedding认为，每个词type有一个embedding，所以就算是不同的token只要是一样的type那么word embedding就是一样的，语义也就是一样的。

而事实上并非如此，1,2句bank指的是银行，3,4为水库。所以我们希望让机器给不同意思的token而且type还一致，给予不同的embedding。在这个问题上，之前的做法是从字典中去查找这个词包含几种意思，但是这样的做法显然跟不上现实中词语的一些隐含的含义。比如bank有银行的意思，与money一起是银行的意思，而与blood一起却是血库的意思。

所以我们想让机器今天进一步做到每一个word token都可以有自己的embedding(之前是每个type有一个embedding或者有固定的一个或多个embedding)，那么怎么知道一个word应该有怎样的embedding呢？我们可以取决于该词的上下文，上下文越相近的token它们就会越相近的embedding。比如之前提到的bank，下面两个句子它们的word token的embedding可能是相近的，而和上面的word token的embedding是相远的。

所以我们想使用一种能够基于上下文的Contextual word Embedding来解决一词多义的问题。

这里使用ELMO可以做到这件事情，即每个word token拥有不同的word embedding。(右上角动物是芝麻街(美国公共广播协会（PBS）制作播出的儿童教育电视节目)里的角色)。

它是基于RNN的预训练模型，它只需要搜集大量语料(句子)且不需要做任何标注，就可以训练这个基于RNN的语言模型，预测下一个token是什么，学习完了之后就得到了上下文的embedding。因为我们可以将RNN的隐藏层中的某一节点拿出来(图中橙蓝色节点)，它就是输入当前结点的词汇的word embedding。

从当计算识别到<BOS>，模型训练开始。首先输入"潮水"，然后当作输入输出"退了"，退了当做输入输出"就"。

假设当前要得到”退了”这个词的上下文embedding，首先，因为前边的RNN只考虑到了前文而没有考虑到后文，所以这里就使用了同前文一样的反向的RNN。然后，它从句尾开始进行，比如给它喂”知道”，它就要预测”就”，给它喂”就”，它就要预测”退了”。这时候就不仅考虑每个词汇的前文，还会考虑每个词的后文。最后将正向和逆向得到的两个不同的上下文embedding(因为方向不同训练结果也不一样)拼接起来。

现在我们训练的程度都会越来越深度，当层数增加，这样就会产生Deep的RNN，因为很多层，而且每一层都会产生上下文Embedding，那么我们到底应该使用哪一层？每一层这种深度LSTM中的每个层都可以生成潜在表示(方框处)。同一个词在不同的层上会产生不同的Embedding，那么我们应该使用哪一层呢？ELMo的策略是每一层得到的上下文embedding都要。

在上下文embedding的训练模型中，每个词输入进去都会有一个embedding输出来。但是在ELMo中，每个词汇输入进去，都会得到不止一个embedding，因为每层的RNN都会给到一个embedding，ELMo将它们统统加起来一起使用。

以图中为例，这里假设ELMo有两层RNN，这里是将α1(黄色，第一层得到的embedding)和α2(绿色，第二层得到embedding)加起来得到蓝色的embedding，并做为接下来要进行不同任务的输入。

但是这里存在一些问题，α1和α2是学习得到的，而且它是根据当前要进行的任务(如QA，POS of tagging )，然后根据接下来要进行的这些任务一起被学习出来。所以就导致不同任务导向下的α1和α2也不一样。

ELMo的论文中提到，在不同任务下(SRL,Coref,SNLI,SQuAD,SST-5)。蓝色的上下文embedding在经过token(这里为没有经过上下文的embedding)，LSTM1，LSTM2后，它在不同阶段需要的weight也不一样。

BERT相当于是Transformer的Encoder部分，它只需要搜集大量的语料去从中学习而不经过标注(不需要label)，就可以将Encoder训练完成。如果之前要训练Encoder，我们需要通过一些任务来驱动学习(如机器翻译)。

BERT就是句子给进去，每个句子给一个embedding。

这里可以回忆下，Transformer的Enoder中有self-attention layer，就是给进去一个sequence，输出也得到一个sequence。

虽然图中使用是用词作为单元进行输入，但是在使用BERT进行中文的训练时，字会是一个更好的选择。比如，我们在给BERT进行输入时，用one-hot给词进行编码，但是词在中文中数量庞大，会导致维度过高。但是，字的话相对会少很多，特别是中文(大约几千个，可以穷举)。这样以字为单位进行输入会占很大优势。

共有两种方法，一种是Mask LM遮盖语言模型，另一种是Next Sentence Prediction下一句预测。

下面用上图的例子来理解BERT是怎么样来进行填空的：

1）这里假设在所有句子中的词汇的第2个位置上设置一个<MASK>；

2）接下来把所有的词汇输入BERT，然后每个输入的token都会得到一个embedding；

3）接下来将设置为<MASK>的embedding输入到Linear Multi-class Classifier中中，要求它预测被<MASK>的词汇是哪个词汇？

但是这个Linear Multi-class Classifier它仅仅是一个线性分类器，所以它的能力十分弱，这也就需要在之前的BERT模型中需要将它的层数等参数设计的相当好，然后得到非常出色的representation，便于线性分类器去训练。

那么我们怎么知道最后得到的embedding是什么样的呢？如果两个<MASK>下的词汇(输入时设置的<MASK>和最后预测的<MASK>)都放回原来的位置而且没有违和感(就是语句还算通顺)，那它们就有类似的embedding(比如退下和落下)。

如图中，给定两个句子1)醒醒吧 和 2)你没有妹妹。其中特殊符号[SEP]是告诉BERT两个句子的分隔点在哪里。

特殊符号[CLS]一般放在句子的开头，它用来告诉BERT从这开始分类任务，[CLS]输入BERT后得到embedding然后通过Linear Binary Classifier得出结果说明：经过BERT预测后现在我们要预测的两个句子是接在一起 or 不应该被接在一起。

这里可能会有疑问，为什么不将[CLS]放在句尾，等BERT训练完两个句子再输出结果？

对于上图中的任务，BERT现在要做的事情就是给定两个句子，让BERT输出结果这两个句子是不是应该接在一起？

所以在语料库的大量句子中，我们是知道哪些句子是可以接在一起的，所以也需要我们告诉BERT哪些句子是接在一起的。

Linear Binary Classifier和BERT是一起被训练的，通过预测下一句这个任务，我们就可以把将BERT部分的最优参数训练出来。

现在我们知道了任务一和任务二，在原论文中两种任务是要同时进行的，这样才能将BERT的性能发挥到最佳。

现在我们知道了BERT要做什么事情，那么我们要如何去使用它？共有四种方法。论文中是将【BERT模型和接下来你要进行的任务】结合在一起做训练。

第一种，假设当前任务是Input一个sentence，out一个class，举例来说输入一句话来判断分类。

训练流程：1）将做要分类的句子丢给BERT；

2）需要在句子开始加上分类的特殊符号，这个特殊符号经过BERT输出的embedding经过线性分类器，输出结果为当前的句子属于的类别是真还是假。BERT和Linear Classifier的参数一起进行学习；

3）这里的Linear Classifier是Trained from Scratch是白手起家从头开始，即它的参数随机初始化设置，然后开始训练；

4）而BERT则是加上Fine-tune微调策略(一种迁移学习方式*)，例如Generative Pre-trained Transformer(OpenAI GPT生成型预训练变换器)(Radford等，2018)，引入了最小的任务特定参数，并通过简单地微调预训练参数在下游任务中进行训练。

*这里不得不提一下迁移学习中的Fine-tune，这里可以参考csdn的一篇文章： https://blog.csdn.net/u013841196/article/details/80919857

( https://arxiv.org/abs/1805.12471 )

第二种，假设当前任务是input一个sentence，输出这个句子中的每个词汇属于正例还是负例。举例现在的任务是slot filling填槽任务(填槽指的是为了让用户意图转化为用户明确的指令而补全信息的过程)（另一种解释是从大规模的语料库中抽取给定实体（query）的被明确定义的属性（slot types）的值（slot fillers））(槽可以理解为实体已明确定义的属性)，输入的句子是 arrive Taipei on November 2nd输出的槽是other dest on time time

训练流程：

1）将句子输入BERT，句子中的每个词汇都会映射出一个embedding；

2）每个词汇的embedding输入Linear Classifier，输出结果；

3）Linear Classifier 白手起家和Bert微调的方式一起去做学习。

第三种，假设当前任务是input输入两个句子，输出class。举例现在要进行自然语言预测，让机器根据premise前提，预测这个hypothesis假设是True还是False还是unknown不知道。实际上，我们可以把这个任务当成三分类问题。

训练过程：

1）在一个sentence前设置特殊符号[CLS]，然后在要输入的两个sentence中间设置[SEP]分隔符号；

2）将两个sentence连同特殊符号一起输入到BERT中；

3）将[CLS]输入BERT后得到的embedding，再把它输入linear Classifier中，得到class。

如图所示，假设gravity的token序号是17，即 ，我们现在有一个问题通过QA Model后得到的s=17，e=17，那么答案就是 为gravity；

同理，假设within a cloud的序号顺序是77到79，即 到 ,我们现在有一个问题通过QA Model后得到的s=77，e=79，那么答案就是 为within a cloud。

https://arxiv.org/abs/1905.05950

https://openreview.net/pdf?id=SJzSgnRcKX

这张图显示了BERT从0-24层的层数在针对不同的NLP任务上的表现。

https://d4mucfpksywv.cloudfront.net/better-language-models/language_models_are_unsupervised_multitask_learners.pdf

而所谓的GPT,它其实就是Transformer的Decoder。

我们简单的描述下GPT的训练过程：这里我们input<BOS>这个token和潮水，想要GPT预测输出“退了”这个词汇。

1）首先输入[BOS]（begin of sentence）和潮水，通过Word Embedding再乘上matrix W变成a 1到a 4，然后把它们丢进self-attention 层中，这时候每一个input都分别乘上3个不同的matrix产生3个不同的vector，分别把它们命名为q，k，v。

q代表的是query (to match others用来去匹配其它的向量)

k代表的是key (to be matched用来去被query匹配的向量)

v代表的是value(information to be extracted用来被抽取的信息的向量)

2）现在要做的工作就是用每个query q 去对每个 key k做attention（吃2个向量，输出就是告诉你这2个向量有多么匹配或者可以说输入两个向量输出一个分数alpha（而怎么去吃2个向量output一个分数，有很多不同的做法））。这里要预测潮水的下一个词，所以乘 ， 乘上 , 乘上 再经过soft-max分别得到 到 。

3)我们用 和每一个v相乘， 和 相乘加上 和 相乘。以此类推并相加，最终得到 。

4)然后经过很多层的self-attention，预测得到”退了”这个词汇。

同理，现在要预测”退了”的下一个词汇，按照前面的流程可以得到 ，然后经过很多层的self-attention层，得到”就”这个词汇。

GPT的神奇之处在于它可以在完全没有训练数据的情况下，就可以做到阅读理解，摘要，翻译。折线图中显示了它在参数量上升的情况下，F1的值的效果。

1.Transformer的问题：

word Embedding 无上下文

监督数据太少

解决方法：

Contextual Word Embedding

2.ELMo( E mbeddings from L anguages Mo del)

- 多层双向的LSTM的NNLM

- RNN-based language models(trained from lots of sentences)

ELMo的问题：

Contextual Word Embedding作为特征

不适合特定任务

3.OpenAI GPT的改进

根据任务Fine-Tuning

使用Transformer替代RNN/LSTM

OpenAI GPT的问题：

单向信息流的问题

Pretraining(1)和Fine-Tuning(2)不匹配

解决办法：

Masked LM

NSP Multi-task Learning

Encoder again

Tips：

- 使用中文模型

- max_seq_length可以小一点，提高效率

- 内存不够，需要调整train_batch_size

- 有足够多的领域数据，可以尝试Pretraining

二、关于硬盘MBR模式下的分区和系统启动的问题，请多指教！

沿用了数十年的PC机主板架构是BIOS模式。但在2004年，微软和英特尔共同推出一种名为可扩展固件接口（EFI）的主板升级换代方案。EFI，即可扩展固件接口(Extensible Firmware Interface)，EFI的位置很特殊，不像是BIOS那样是固件又是接口，EFI只是一个接口，位于操作系统与平台固件之间。到目前为止，现有的PC机主板绝大部分还是BIOS模式，EFI主板寥寥可数。

MBR，主引导记录(Master Boot Record)，也就是现有的硬盘分区模式。MBR分区的标准决定了MBR只支持在2TB以下的硬盘，超过2TB的硬盘只能管理2TB！为解决这个大问题，微软和英特尔在EFI方案中开发了GPT分区模式。

GPT，全局唯一标识分区表(GUID Partition Table)，GUID，全局唯一标识符 (Globally Unique Identifier) 。GPT是EFI方案的一部分，但并不依赖于EFI主板，在BIOS主板的PC中也可使用GPT分区。与MBR最大4个分区表项的限制相比，GPT对分区数量没有限制，但Windows最大仅支持128个GPT分区。GPT可管理硬盘大小达到了18EB(1EB=1024PB=1,048,576TB)，不过NTFS格式最大仅支持256TB。

GPT的分区信息是在分区中，而不象MBR一样在主引导扇区，为保护GPT不受MBR类磁盘管理软件的危害，GPT在主引导扇区建立了一个保护分区(Protective MBR)的MBR分区表，这种分区的类型标识为0xEE，这个保护分区的大小在Windows下为128MB，Mac OS X下为200MB，在Window磁盘管理器里名为GPT保护分区，可让MBR类磁盘管理软件把GPT看成一个未知格式的分区，而不是错误地当成一个未分区的磁盘。

2008年，硬盘容量突飞猛进，1.5T硬盘价格已降至RMB900元以下，在咱们CCF硬件版的帖子就可以看出，1.5T硬盘都已开始在CCFer中普及啦。。。。单碟500G的硬盘也已经面市，预计2T、2.5T硬盘在2009年就会面市。可是，2009年你想把旧硬盘换成2.5T硬盘？且慢！。。。由于MBR分区模式最大只能支持2TB硬盘，2.5T硬盘必须使用GPT分区模式！我们先未雨绸缪，看看Windows对GPT分区的支持情况：

1. Windows 95/98/ME、Windows NT 4、Windows 2000、Windows XP 32 位版本不支持GPT分区，只能查看GPT的保护分区，GPT不会被装载或公开给应用软件；

2. Windows XP x64 版本只能使用GPT磁盘进行数据操作，只有基于安腾处理器 （Itanium）的 Windows系统才能从 GPT 分区上启动；

3. Windows Server 2003 32bit Server Pack 1 以后的所有Windows 2003版本都能使用GPT分区磁盘进行数据操作，只有基于安腾处理器（Itanium）的Windows系统才能从 GPT 分区上启动；

4. Windows Vista 和 Windows Server 2008的所有版本都能使用GPT分区磁盘进行数据操作；但只有基于EFI主板的系统支持从GPT启动。

I never think of the future. It comes soon enough.

三、GOT比GPT高

【 原 理 】

转氨酶是体内重要的一类酶.转氨酶催化α–氨基酸的α–氨基与α–酮酸的α–酮基之间的相互转化,从而生成一种新的氨基酸与一种新的酮酸,这种作用称为转氨基作用.它在生物体内蛋白质的合成,分解等中间代谢过程中,在糖,脂及蛋白质三大物质代谢的相互联系,相互制约及相互转变上都起着很重要的作用.

在动物机体中活力最强,分布最广的转氨酶有两种:一种为谷氨酸草酰乙酸转氨酶(glutamic-Oxaloacetate transaminase简称GOT),另一种为谷氨酸丙酮酸转氨酶(glutamic-pyruvic transaminase简称GPT).本实验以谷氨酸丙酮酸转氨酶为例.它的催化反应如下:

GPT

丙氨酸 + α–酮戊二酸 谷氨酸 + 丙酮酸

37℃

由上可见此反应最终产物是丙酮酸.测定单位时间内丙酮酸的产量即可得知转氨酶的活性.

丙酮酸可与2,4–二硝基苯肼反应,形成丙酮酸二硝基苯腙,在碱性溶液中呈棕红色,显色的深浅在一定范围内可反映所生成的丙酮酸量多少,与同样处理的丙酮酸标准液进行比色,计算出其含量,以此测定转氨酶的活性.

丙酮酸 + 2,4–二硝基苯肼 丙酮酸–2,4–二硝基苯腙(棕红色)

本实验用金氏(King)法(1)测定转氨酶的活性单位为:每毫升血清与基质在37℃下作用60分钟,生成1μmol丙酮酸为1个单位.

【 试剂和器材 】

一 试剂

1.1/15 mol/L pH7.4磷酸盐缓冲溶液:

甲液:1/15 mol/L磷酸氢二钠溶液:称取磷酸氢二钠(Na2HPO4)9.47g(或Na2HPO4 · 12H2O 23.87g)溶解于蒸馏水中,定容至1 000 ml.

乙液:1/15 mol/L磷酸二氢钾溶液:称取磷酸二氢钾(KH2PO4)9.078g,溶解于蒸馏水中,定容至1 000 ml.

取甲液825 ml乙液175 ml混合,测其pH为7.4即1/15 mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液.

2.GPT基质液:精确称取a–酮戊二酸29.2 mg及DL–丙氨酸1.78g,溶于1/15 mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液50ml 中溶解,加1mol/L NaOH溶液0.5ml,校正pH至7.4.再以pH 7.4的磷酸缓冲液定容至100ml,充分混合,冰冻贮存.

3.2,4–二硝基苯肼溶液:精确称取2,4–二硝基苯肼20mg,先溶解于10ml浓盐酸中(可加热助溶),再以蒸馏水稀释至100ml(有沉渣可过滤),棕色瓶内保存.(注意:此溶液配制时释放大量的热和难闻气味配制时应戴上口罩)

4.丙酮酸标准液(1ml = 2μmol丙酮酸即2mmol/L):精确称取丙酮酸钠22mg于100ml容量瓶中,用1/15 mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲溶液稀释至刻度.此溶液应新鲜配制,不能存放.

5.0.4 mol/L氢氧化钠溶液:称取16g氢氧化钠溶解于蒸馏水中,定容至1 000ml.

6.1mol/L氢氧化钠溶液:称取4g氢氧化钠溶解于蒸馏水中,定容至1 00ml.

7.血清300ml.

二 器材

1.水浴锅.

2.分光光度计.

【 操 作 】

1.标准曲线制作:取6支试管按下表操作.

试管号

试 剂

1 2 3 4 5 6

丙酮酸标准液 (ml)

GPT基质液 (ml)

PH7.4磷酸缓冲液(ml)

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25

0.5 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25

0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

水浴37℃,10分钟

2,4二硝基苯肼溶液(ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

保温37℃,20分钟

0.4N氢氧化钠溶液 (ml) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0

相当活性(单位数) 空白 100 200 300 400 500

混匀后,用分光光度计在520nm波长处进行比色测定,以空白调零,读取各管吸光度读数.以各管相应的转氨酶活性单位值为横坐标,吸光度值为纵坐标,用坐标纸绘制标准曲线.

2.GPT测定:取2支洁净的试管按下表操作.

试 剂 空 白 测 定

血 清 (ml) 0.1 0.1

G PT基质液 (ml) -- 0.5

混匀, 37℃水浴,60分钟

G PT基质液 (ml) 0.5 --

2,4二硝基苯肼溶液 (ml) 0.5 0.5

混匀, 37℃水浴,20分钟

0.4mol/L氢氧化钠 (ml) 5.0 5.0

混匀,放置5分钟,用分光光度计在波长520nm波长处进行比色测定,以空白调零,读取测定管吸光度值.

【 实验结果 】

所测得的吸光度值在已绘制好的标准曲线上直接查对,即可得知待测转氨酶的活性单位.

【 注意事项 】

1.测定血清中转氨酶活性主要有金氏 (King) 法,赖氏 (Reitman—Frankel)法和改良穆氏(Mohun)法.这三种方法的原理,试剂和操作方法包括血清和试剂的用量及作用温度均相同,不同之处是金氏法酶作用时间为60分钟,而其他二法为30分钟.因此活性单位定义不同.

2.转氨酶只作用于L–型氨基酸,对D–型氨基酸无催化能力.实验中所用的是DL–型的混旋氨基酸.若采用L–型时,则用量比DL–型少一半.

3.所用仪器应清洁,不应含有酸,碱,Zn2+,Ca2+,Hg2+,Ag+等蛋白沉淀剂.

4.血清不应溶血,因血细胞内转氨酶含量较多.样品采集后应当日进行测定,否则应将血清分离后贮存于冰箱.

5.温度及时间一定要严格控制,准确掌握.pH要准确以免影响酶活性.

实验二 过氧化氢酶及过氧化物酶的作用

【 原 理 】

在生物机体内,某些代谢物由于需氧脱氢的结果而产生对机体有害的过氧化氢.体内的过氧化氢酶能催化过氧化氢分解成水和分子氧,使过氧化氢不致在体内积累.因此,过氧化氢酶具有保护生物机体的作用.

过氧化氢酶是一种以铁卟啉为辅基的酶,它广泛存在于动植物组织中.

过氧化物酶也是一种以铁卟啉为辅基的酶,它能催化过氧化氢释放出新生态氧以氧化某些酚类和胺类物质,例如,氧化溶于水中的焦性没食子酸生成不溶于水的焦性没食子橙(橙红色).其作用机制如下:

E + H2O2 E–H2O2

E–H2O2 + H2O2 E + 2 H2O + O2

【 试剂和器材 】

一 试剂

2%过氧化氢溶液:此溶液易见光分解,应新鲜配制.

1%焦性没食子酸溶液:焦性没食子酸1g,用蒸馏水溶解并配至100ml.此溶液易

氧化,应新鲜配制.

铁粉.

二 材料

鲜猪肝糜.

马铃薯或血液.

白菜梗提取液:白菜梗约5g,切成细块,置研钵内,加蒸馏水15ml研磨成浆,转

移出滤液,备用.

【 操 作 】

1.过氧化氢酶的作用

取试管5支,按下表操作:

试管 2% H2O2(ml) 新鲜肝糜 (g) 煮沸肝糜(g) 生马铃薯(g) 熟马铃薯(g) 铁粉

1 3 0.5 - - - -

2 3 - 0.5 - - -

3 3 - - 1 - -

4 3 - - - 1 -

5 3 - - - - 少许

加毕,观察有无气泡放出,特别是肝糜周围和马铃薯周围.

2.过氧化物酶的作用

取试管4支,按下表操作:

试管 1%焦性没食子酸 2% H2O2 蒸馏水 白菜梗提取液 煮沸的白菜梗提取液

(ml) (滴) (ml) (ml) (ml)

1 2 2 2 - -

2 2 - - 2 -

3 2 2 - 2 -

4 2 2 - - 2

摇匀后,观察并记录各管颜色变化和沉淀的出现.

实验三 琥珀酸脱氢酶及丙二酸的抑制作用

【 原 理 】

琥珀酸脱氢酶是三羧酸循环中的一个重要的酶,测定细胞中有无这种酶可以初步鉴定

三羧酸循环途径是否存在.琥珀酸脱氢酶可使其底物脱氢,产生的氢可通过一系列传递体最后递给氧而生成水.在缺氧的情况下,若有适当的受氢体也可显示出脱氢酶的作用.如心肌中的琥珀酸脱氢酶在缺氧的情况下,可使琥珀酸脱氢生成延胡索酸,脱下之氢可将蓝色的甲烯蓝还原成无色的甲烯白.这样,便可以显示琥珀酸脱氢酶的作用.

琥珀酸 + 甲烯蓝 琥珀酸脱氢酶 延胡索酸 + 甲烯白

丙二酸的化学结构与琥珀酸相似,它能与琥珀酸竞争而和琥珀酸脱氢酶结合.若琥珀酸脱氢酶已与丙二酸结合,则不能再催化琥珀酸脱氢,这种现象称为竞争性抑制.如相对地增加琥珀酸的浓度,则可减轻丙二酸的抑制作用.

【 试剂和器材 】

一 试剂

1.1.5%琥珀酸钠溶液:取琥珀酸钠1.5g,用蒸馏水溶解并稀释至100ml.如无琥珀酸钠可用琥珀酸配成水溶液后,以氢氧化钠溶液中和至pH7~8.

2.1%丙二酸钠溶液:取丙二酸钠1g,用蒸馏水溶解并稀释至100ml.

3.0.02%甲烯蓝溶液.

4.1/15mol/LNa2HPO4溶液:取Na2HPO4 · 2H2O 11.88g,用蒸馏水溶解并稀释至1 000ml.

5.液体石蜡.

二 器材

1.玻璃匀浆器.

2.离心机.

三 材料

新鲜猪心.

【 操 作 】

1.猪心脏制备液:称取新鲜猪心1.5~2.0g玻璃匀浆器放中,加入等体积的石英砂及1/15mol/LNa2HPO4溶液3~4ml,捣碎成浆,再加入6~7ml1/15mol/LNa2HPO4溶液,放置一小时,不时摇动,离心(3000r/min 10 min)取上清液备用.

2.取4支试管,编号并按下表操作:

试管 心脏制备液 1.5%琥珀酸钠溶液 1%丙二酸钠溶液 蒸馏水 0.02%甲烯蓝溶液

(滴) (滴) (滴) (滴) (滴)

1 5 5 - 10 2

2 5(先煮沸) 5 - 10 2

3 5 5 5 5 2

4 5 10 5 5 2

3.各管溶液混匀后,每管各加液体石蜡一薄层(约5~10滴).为什么

4.各管置于37℃水浴中,半小时内观察各管颜色变化,比较其速度并说明原因.然后将第一管用力摇动,观察其有何变化 为什么

实验四 γ–球蛋白的分离

【 原 理 】

中性盐 (如硫酸铵,硫酸钠,氯化钠,硫酸镁等)对球状蛋白质的溶解度有显著影响.随着中性盐浓度的增加,离子强度也增加.当溶液离子强度增加到一定数值时,溶液中蛋白质的溶解度开始下降.离子强度增加到足够高时,蛋白质可从水溶液中沉淀出来,这种现象叫做盐析.各种蛋白质的溶解度不同,因而可利用不同浓度的高浓度盐溶液来沉淀分离各种蛋白质.

蛋白质是一种生物大分子,它具有不能通过半透膜的性质.透析就是利用这种性质使之与其它小分子物质如无机盐,单糖等分开.本次实验应用的是脱盐透析,即盐析后,将含大量盐类的蛋白质溶液放在半透膜的袋内,再将透析袋浸入蒸馏水中.经过一段时间,袋内的盐类浓度即逐渐降低.若经常更换袋外的液体,最后即可使袋内的蛋白质溶液中所含的盐类除净,从而达到脱盐的目的.应用不同浓度硫酸铵分段盐析法将血清中γ–球蛋白及α,β球蛋白分离,最后用透析法脱盐,即可得到纯度较高的γ–球蛋白.

【 试剂和器材 】

一 试剂

1.pH 7.2,0.01mol/L磷酸盐缓冲液生理盐水(简称PBS): 取0.2mol/L Na2HPO4溶液36.0ml,0.2mol /L NaH2PO4溶液14.0ml混合,加NaCl 8.5克,用蒸馏水稀释至1 000ml.

2.pH7.2饱和硫酸铵溶液:用浓氨水将2 000ml饱和硫酸铵溶液调pH到7.2.

3.纳氏试剂:

纳氏试剂贮存液:于500ml三角烧瓶内加入碘化钾150克,碘110克,汞50克及蒸馏水l00ml,用力振荡7~15分钟,至碘色将转变时,此混合液即产生高热.随即将此烧瓶浸于冷水内振荡,直至棕色之碘转变成带绿色之碘化钾汞溶液为止.将上清液倾入2 000ml量筒内,并用蒸馏水洗涤瓶内沉淀物数次.将洗涤液一并倾入量筒内,加蒸馏水至2 000ml刻度后,混匀即成.

纳氏试剂应用液:取10%氢氧化钠700ml,钠氏试剂贮存液150ml及蒸馏水150ml混匀即成,如显混浊,可静置数日后取上清液使用.此试剂之酸碱度极为重要.用lmol/L盐酸溶液20ml滴定时,需此试剂11～11.5ml恰好使酚酞指示剂变成红色时最为适宜.否则必须纠正其酸碱度.

4.双缩脲试剂:溶解1.50克硫酸铜(CuSO4·5H2O)和6.0克酒石酸钾钠(NaKC4H406 · 4H20)于500ml蒸馏水中.在搅拌下加入10%氢氧化钠溶液300ml,用蒸馏水稀释到1升,贮存在内壁涂以石蜡的瓶中,可长期保存.

5.浓蔗糖液:蔗糖的饱和溶液.

6.10%氢氧化钠:取10克氢氧化钠溶解于蒸馏水中,定容至100ml.

二 器材

1.透析袋.

2.磁力搅拌器.

3.离心机.

三 材料

兔血清

【 操 作 】

一 盐析

1.取离心管1支加入血清2ml,再加入等量PBS稀释血清,摇匀后,逐渐加入pH7.2饱和硫酸铵溶液2ml(相当于33%饱和度硫酸铵),边加边摇.然后静止半小时,再离心(3 000r/min)20分钟,倾去上清液(主要含白蛋白).

2.用lml PBS将离心管底部的沉淀搅拌溶解,再逐滴加饱和硫酸铵溶液0.5m1.摇匀后放置半小时,离心(3 000r/min)20分钟,倾去上清液(主要含α,β球蛋白),其沉淀即为初步纯化的γ–球蛋白.如要得到更纯的γ–球蛋白,可重复盐析过程1～2 次.

3.把提取的γ–球蛋白用1 mlPBS悬浮.

二 透析脱盐与浓缩

1.将盐析得到的γ–球蛋白放入透析袋内,用线绳缚紧上口,用玻璃棒悬在盛有半杯蒸馏水的100ml烧杯中,使透析袋下半部浸入水中.

2.将烧杯放在磁力搅拌器上搅拌1小时以上(中间换水1～2次),然后将透析袋取下.小心将线绳解开,吸取袋内的液体,与烧怀中的水同时用双缩脲试剂检查袋内外的蛋白质,用纳氏试剂检查袋内外液体中的铵离子(NH4+),观察透析法的脱盐效果.

3.脱盐后得到的γ–球蛋白溶液可继续浓缩,即用透析袋装好悬于盛有10ml浓蔗糖或聚乙二醇溶液的小烧杯内1小时以上,观察袋内液体体积的变化.

实验五 γ–球蛋白含量测定(光度分析法)

【 原 理 】

双缩脲法是蛋白质光度分析法的一种,是利用蛋白质的双缩脲反应而测定蛋白质含量的方法.因蛋白质含有两个以上的肽键,所以有双缩脲反应.在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物,其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比,而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关.在一定的实验条件下,未知样品溶液与标准蛋白质溶液同时反应,并于540~560nm测定,即可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度.

【 试剂和器材 】

一 试剂

1.标准酪蛋白溶液(5mg/ml):用0.05mol/L NaOH溶液配制:5g酪蛋白加0.05mol/L NaOH溶液至1 000ml.

2.双缩脲试剂:溶解1.5g硫酸铜(CuSO4 · 5H2O)和6.0 g酒石酸钾钠(NaKC4H4O6 · 4H2O)于500ml蒸馏水中.在搅拌下加入10% NaOH溶液300ml,用蒸馏水稀释到1升,贮存在内壁涂有石蜡的瓶中,可长期保存.

3.未知蛋白质溶液:γ–球蛋白溶液.

二 器材

分光光度计.

【 操 作 】

1.标准曲线的绘制:取6支试管按下表操作.

试 剂 1 2 3 4 5 6

标准酪蛋白溶液(ml) 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0

蒸馏水 (ml) 2 1.6 1.2 0.8 0.4 0

双缩脲试剂 (ml) 4 4 4 4 4 4

室温下(15~25℃)放置30分钟,用分光光度计于540nm测定.以光密度为纵坐标,酪蛋白含量为横坐标用坐标纸绘制标准曲线.

2.γ–球蛋白溶液浓度的测定:取3支试管按下表操作.

试 剂 空白管 测定1 测定2

γ–球蛋白溶液(ml) - 1 1

蒸馏水 (ml) 2 1 1

双缩脲试剂 (ml) 4 4 4

摇匀,放置30分钟,540nm测定读取光密度.

【 实验结果 】

求出待测蛋白质溶液的光密度后,从标准曲线上查出其蛋白质浓度,按稀释倍数求出每毫升蛋白质溶液的蛋白质含量.

实验六 凝胶柱层析法(γ–球蛋白纯化)

【 原 理 】

凝胶层析(gel chromatography),又称为凝胶过滤(gel filtration),分子筛过滤(molecular sieve filtration),凝胶渗透层析(gel osmotic chromatography)等.它是20世纪60年代发展起来的一种层析技术.其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相(凝胶)具有分子筛的特点,将被分离物质各成分按分子大小分开,达到分离的方法.

凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构.网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半固体状态.人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼,小于筛眼的物质分子均可通过,大于筛眼的物质分子则不能,故称为"分子筛".凝胶之所以能将不同分子的物质分开是因为当被分离物质的各成分通过凝胶时,小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼,并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动,从一个颗粒的网眼流出,又进入另一颗粒的网眼,如此连续下去,直到流过整个凝胶柱为止,因而流程长,阻力大,流速慢;大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼,只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动,其流程短,阻力小,流速快,比小分子先流出层析柱;小分子最后流出.分子大小介于完全排阻不能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质分子,则居中流出.这样被分离物质即被按分子的大小分开.

用于凝胶层析的凝胶均为人工合成的产品,主要有交联葡聚糖(商品名为Sephadex),琼脂糖(商品名为Sepharose),聚丙烯酰胺凝胶(商品名为Bio–gel)及具有一定网眼的细玻璃珠等和这些

四、比chatgpt更新的技术是

GPT-3：GPT-3是由OpenAI开发的语言模型，拥有比我更多的参数和更高的精度，能够生成更加自然、流畅的文本。

AlphaFold：AlphaFold是DeepMind开发的人工智能系统，能够预测蛋白质的三维结构，对于生物学和药物研发等领域具有重要意义。

自动驾驶技术：自动驾驶技术是一个涵盖多个领域的复杂系统，涉及计算机视觉、机器学习、控制系统等多个技术领域，目前在一些公司和实验室已经有了初步的应用。

量子计算：量子计算是一种基于量子力学原理的计算方法，拥有比传统计算机更高的计算速度和效率，在一些领域如密码学、化学模拟等有广泛应用前景。

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